Статья по «Мониторингу»

вторник, 16 марта 2021 г.

ВВЕДЕНИЕ. Ухудшение экологической обстановки сопровождается значительным ростом заболеваний щитовидной железы (ЩЖ), особенно в районах, где снижено содержание йода в воде или повышена загрязненность окружающей среды, в том числе радиоактивными продуктами [1,9]. В последние десятилетия в разных странах  проводят регулярные масштабные обследования функционального состояния ЩЖ как в группах риска или у населения определенных регионов, так и во всей популяции [8,10,11]. Это позволяет выявить дисфункцию ЩЖ на ранних стадиях и, в конечном итоге, обеспечивает проведение своевременной терапии и повышение качества жизни в целом [13].

В основе развития заболеваний щитовидной железы часто лежат аутоиммунные механизмы, связанные с выработкой аутоантител. Поэтому для более полной характеристики тиреоидного статуса пациента  к скрининговым исследованиям на тиротропин (ТТГ) и тироксин (Т4) добавляют анализ на аутоантитела к тиреопероксидазе (ТПО) и тироглобулину (ТГ).

Определение концентраций антител к ТПО  -  один из наиболее чувствительных тестов для диагностики аутоиммунных заболеваний щитовидной железы, которые являются основным фактором, лежащим в основе гипотиреоза и гипертиреоза, и развиваются обычно у генетически предрасположенных людей. Определение уровня антител к ТГ позволяет оценить выраженность аутоиммунных реакций. Повышение уровня таких антител наблюдается в большинстве случаев тиреоидита Хашимото, болезни Грейвса и идиопатической микседемы. Антитела к тиреоглобулину обнаруживаются также у больных раком щитовидной железы при наличии регионарных метастазов [4-7,12, 14-16].

Уровень аутоантител обычно определяют в сыворотке крови. Однако для массовых исследований более удобно использовать высушенные на специальной фильтровальной бумаге пятна крови. Это связано с упрощением процедуры взятия капиллярной крови из пальца пациента, низкой стоимостью сбора, транспортировки и хранения проб в пластиковых герметичных пакетах, особенно из отдаленных регионов. Манипуляции с бумажными бланками более безопасны, чем с цельной кровью, так как многие опасные вирусы при высушивании теряют инфекционность вследствие разрушения вирусной оболочки [3].

Ранее нами продемонстрирована возможность  определения тиротропина и свободного тироксина в сухих пятнах крови с использованием тестов, разработанных на основе метода лантанидного иммунофлуоресцентного анализа (ЛИФА)  [2]. Уровень ТТГ и свободного Т4 в сухих пятнах крови в ЛИФА коррелировал с содержанием этих аналитов в сыворотке крови при исследовании в коммерческих тестах на основе  иммуноферментного анализа (ИФА). В настоящей работе приведены результаты разработки на основе ЛИФА тестов для определения анти-ТГ и анти-ТПО в сухих пятнах крови и оценена возможность их использования совместно с ранее разработанными методиками (определение ТТГ и свободного Т4) для получения комплексной информации  о тиреоидном статусе пациента.

Цель работы  -  разработка методик ЛИФА для выявления аутоиммунных антител к тироглобулину и тиреопероксидазе в высушенных на фильтровальной бумаге пятнах крови и их клиническая апробация в сравнении с результатами анализа сывороток в ИФА.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Клинические образцы в виде высушенных пятен крови получены из  ООО «Научный центр ЭФиС» в 2012 году. Кровь у пациентов брали натощак из пальца и наносили в виде падающей капли на специальный бланк из фильтровальной бумаги Whatman 903 (США). Бланки с кровью высушивали на воздухе и хранили до исследования в герметично закрытом полиэтиленовом пакете при температуре +2-8оС. Предварительно сыворотки крови этих пациентов были исследованы на ауто-антитела к ТГ и ТПО с помощью иммуноферментных наборов фирмы DRG Inc., Германия.

Калибровочные пробы для разрабатываемых методик ЛИФА представляли собой сухие пятна крови, содержащие аутоиммунные антитела в концентрации 0, 30, 100, 300, 1000, 3000 МЕ/мл сыворотки (анти-ТГ) или 0, 10, 30, 100, 300, 1000 МЕ/мл сыворотки (анти-ТПО). Для их приготовления использовали сыворотки с высоким уровнем антител (по данным исследования наборами фирмы DRG), которые вносили в цельную кровь человека до необходимой концентрации, затем раскапывали по 100 мкл на фильтровальную бумагу Whatman 903 и высушивали. Приготовленные калибровочные пробы обеспечивали определение анти-ТГ и анти-ТПО в клинически значимом диапазоне концентраций и соответствовали по содержанию аналитов калибраторам из ИФА-наборов.

ЛИФА проводили как описано ранее [2] с использованием стадии предварительной экстракции аутоантител к ТГ и ТПО до постановки реакции. Из пятен крови на бумаге выбивали панчером диски диаметром 3,2 мм, помещали их в несорбирующий планшет и инкубировали в 100 мкл реакционного буфера  при комнатной температуре и встряхивании. Необходимое число дисков и время экстракции определяли в предварительных экспериментах по оптимизации методик ЛИФА.

Стадии иммуноанализа включали инкубацию 75 мкл экстракта с тироглобулином или тиреопероксидазой (ООО «Хема», Москва), иммобилизованными в лунках 96-луночного стрипированного планшета, а затем  с конъюгатом мышиных моноклональных антител против иммуноглобулина человека с ионами европия; на финальной стадии вносили усиливающий раствор и  измеряли интенсивность флуоресценции на индикаторе Диагем (ЗАО ИММУНОСКРИН, Москва).

Концентрацию аутоантител к ТГ и ТПО в клинических образцах (сухих пятнах крови) определяли по соответствующим калибровочным кривым в разработанных на основе ЛИФА методиках. Для удобства интерпретации результатов значения концентраций приведены в пересчете на содержание антител в сыворотке.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

В предварительных экспериментах по оптимизации разрабатываемых методик установлено следующее. Для достижения требуемого уровня чувствительности (какого?) при определении анти-ТГ и анти-ТПО антител достаточно использовать один сухой диск крови диаметром 3,2 мм. Это обеспечивает существенную экономию биоматериала по сравнению, например, с методикой иммуноанализа ТТГ, для проведения которой требуется не менее 5 дисков [2]. Для полной экстракции аутоантител в реакционный буфер, также как при определении ТТГ [2], было достаточно инкубировать пропитанный кровью диск в в течение 60 мин. при встряхивании.

Все последующие эксперименты проводили с учетом выбранного режима предварительной экстракции. Типичные калибровочные кривые, построенные в координатах «Интенсивность флуоресценции, имп/с – концентрация анти-ТПО или анти-ТГ в калибровочных пробах, МЕ/л», представлены на рисунке.

Рисунок. Типичные калибровочные кривые для определения анти-ТПО (А) и анти-ТГ (Б) антител в сухих пятнах крови

Калибровочные кривые были линейны на протяжении всего динамического диапазона концентраций аутоантител, содержащихся в калибровочных пробах: от 0 до 3000 МЕ/мл (анти-ТГ) или от 0 до 1000 МЕ/мл (анти-ТПО).  Минимальная достоверно определяемая концентрация (чувствительность) в ЛИФА оказалась выше, чем в тестах на основе ИФА, составив 8 МЕ\мл для анти-ТГ или 3 МЕ/мл для анти-ТПО.

Воспроизводимость результатов измерений в сухих пятнах крови (коэффициент вариации) оценивали по результатам 12 повторных измерений каждого из 5 образцов с низкой, средней и высокой концентрацией аутоантител. Коэффициент вариации измерений не превысил 15% (таблица 1), что соответствует техническим требованиям, предъявляемым к методам измерений аналитов с использованием сухих пятен крови.

Таблица 1. Воспроизводимость результатов ЛИФА при измерении концентраций аутоиммунных антител к тироглобулину и тиреопероксидазе в высушенных на фильтровальной бумаге пятнах крови

Номер образца

Число измерений

Определение анти-ТГ

Определение анти-ТПО

Концентрация, МЕ/мл

Коэффициент вариации, %

Концентрация, МЕ/мл

Коэффициент вариации, %

1

12

12,2±1,1

9,0

12,3±1,8

14,6

2

12

18,7±2,7

14,7

29,3±4,4

15,0

3

12

23,5±3,1

13,2

155±18,6

12,0

4

12

81,4±10,1

12,4

161±13,1

8,1

5

12

2000±256

12,8

346±20,8

6,0

Клиническую апробацию разработанных методик ЛИФА с использованием сухих пятен крови (исследованы 23 пробы) проводилив сравнении с данными ИФА, полученными при исследовании сывороток крови тех же пациентов.

Для оценки результатов ИФА использовали рекомендации производителя тест-систем: пороговый уровень анти-ТПО антител - 50 МЕ\мл, концентрация 50-75 МЕ\мл считается пограничной, повышенный уровень антител соответствует значениям, превышающим 75 МЕ\мл. Для анти-ТГ антител эти значения составляют 100 МЕ\мл (пороговый уровень), 100-150 МЕ\мл (пограничная концентрация), более 150 МЕ\мл (повышенный уровень).

С учетом этих рекомендаций нормальный уровень анти-ТПО или анти-ТГ антител в сыворотке крови установлен методом ИФА, соответственно, у 9 из 23 (39%) или у 9 из 10 (90%) обследованных пациентов (Таблица 2). Повышенный уровень анти-ТПО антител выявлен у 14 из 23 (61%) пациентов.

Результаты определения в ЛИФА концентраций анти-ТГ и анти-ТПО антител при исследовании клинических образцов (сухих пятен крови) приведены в таблице 2 в сопоставлении с данными анализа сывороток, полученных от тех же пациентов, в коммерческих ИФА-наборах.

Результаты определения концентраций анти-ТПО и анти-ТГ методом ЛИФА в сухих пятнах крови пациентов с различным тиреоидным статусом                   Таблица 2

№ п\п

Измерено в ИФА (анализ сывороток)

Измерено в ЛИФА

(анализ сухих пятен крови)

концентра-ция ТТГ, мкМЕ\мл

(ПУ 0,2-5)

концентра-ция свТ4, пмоль\л

концентра-ция, анти-ТПО, МЕ\мл

(ПУ 50)

концентра-ция, анти-ТГ, МЕ\мл

(ПУ 100)

концентра-ция ТТГ, мкМЕ\мл

концентра-ция свТ4, пмоль\л

концентра-ция, анти-ТПО, МЕ\мл

(ПУ 50)

концентра-ция, анти-ТГ, МЕ\мл

(ПУ 100)

1

<0,01

16,5

-

<20

<0,2

17,82

-

8,46

2

<0,01

52,14

-

<20

<0,2

50,09

-

6,77

5

0,19

10,26

<10

28,8

0,24

10,07

9,2

104

10

1,99

9,51

<10

-

2,27

11,53

4,2

-

14

4,22

9,43

<10

<20

4,76

10,63

8,6

23,5

7

0,50

14,4

12,3

<20

0,69

13,47

8,4

11,5

8

0,88

8,22

13

<20

1,09

10,42

11,8

7,45

11

2,72

15,95

28,9

-

3,6

14,37

12,4

-

6

0,33

14,05

29,3

-

0,4

13,94

9,6

-

18

11,1

8,6

155

<20

12,7

8,21

138

18,7

16

7,0

9,41

161

-

7,8

10,61

133

-

9

1,13

10,4

262

88,7

1,27

11,09

184

-

4

0,024

22,82

346

-

<0,2

25,95

169

-

13

4,2

11,84

398

-

4,9

10,53

243

-

15

4,67

11,76

420

-

4,72

10,12

129

-

20

16,3

10,23

432

-

17,6

12,3

241

-

3

<0,01

21,65

> 1000

-

<0,2

22,72

438

-

12

2,92

8,73

> 1000

> 3000

3,41

7,98

3230

2000

17

7,02

9,45

> 1000

-

7,98

8,24

698

-

19

11,58

12,44

> 1000

-

13,2

13,84

635

-

21

18,1

9,76

> 1000

<20

20,0

8,93

1550

12,2

22

27,1

8,55

> 1000

-

29,2

7,86

3370

-

23

173,8

7,92

> 1000

-

189,3

7,02

606

-

Примечание: “-“ – значение не измеряли

Как видно из приведенной таблицы результатов, концентрации аутоантител, измеренные в сухих пятнах,  демонстрируют хорошее совпадение с результатами анализа сывороток крови пациентов, полученных с использованием коммерческих тест-систем.     Приведенные результаты позволяют предположить, что разработанные методики могут адекватно отражать тиреоидный статус. Анализ сухих пятен крови в ЛИФА обеспечивает определение значений концентраций аутоантител,  в основном, сходных с референс-значениями, установленными производителями ИФА-наборов. Также разработанный  подход правильно характеризует исследуемые образцы по параметру норма/патология. В качестве порогового значения нормы для анти-ТГ было выбрано значение 100 МЕ/мл, а для анти-ТПО – 50 МЕ/мл в пересчете на сыворотку. Клинические образцы как, например, №3, 5, 7, показывающие аутоиммунные изменения (повышенный уровень ТПО), имеют также  повышенный уровень ТТГ (предварительно измеренный в ИФА), что позволяетпредположить состояние гипотиреоза и аутоиммунного тироидита. Такой результат необходимо проверить с учетом общей клинической картины состояния пациента. Образцы, показывающие повышенный уровень аутоантител и нормальные показатели концентраций ТТГ и Т4, также обращают на себя внимание, так как эти пациенты в следствие своего иммунного статуса нуждаются в наблюдении эндокринолога, и, возможно, иммунолога; регулярном контроле состояния функции щитовидной железы, что в случае развития гипотиреоза позволит своевременно начать корректирующую гормональную терапию. Таким образом, применение описанных методик выявления аутоантител в комплексе с количественным определением концентраций ТТГ и Т4 в сухих пятнах крови по аналогичным ранее апробированным методикам позволит получить полную картину тиреоидного статуса пациента.

ВЫВОДЫ

Разработаны, оптимизированы и апробированы методики измерения уровня аутоантител к щитовидной железе (анти-ТГ и анти-ТПО) в высушенных на бумажных бланках пробах крови. Разработанные тесты в комплексе с ранее описанными тестами для определения ТТГ и Т4 в сухом пятне крови могут составить основу для массового, скринингового обследования щитовидной железы, что может быть полезно при мониторинге влияния различных вредных факторов производства и окружающей среды на здоровье персонала и населения проблемных регионов.

ЛИТЕРАТУРА

  1. Проблемы оценки риска здоровью населения от воздействия факторов окружающей среды под ред. Рахманина Ю.А.и Онищенко Г.Г.,  М., 2004 г.
  2. Помелова В.Г., Бекман Н.И.,  Ларичева С.Ю., Быченкова Т.А.,   Осин Н.С., Злобин В.Н., Теплякова О.В., Адамова Г.В., Азизова Т.В. Контроль уровня тироидных гормонов у взрослого населения с использованием высушенной на фильтровальной бумаге капиллярной крови. //Медицина экстремальных ситуаций. –  2009. – № 3(29). –  С. 43-50.
  3. Помелова В.Г., Осин Н.С. Перспективы интеграции технологии сухого пятна крови в популяционные исследования здоровья и среды обитания человека. //Вестник РАМН. –   2007. –№12.–  С.10-16.
  4. Akamizu T. Monoclonal antibodies to thyroid specific autoantigens // Autoimmunity. —2003. — V. 36(6–7). — P. 361–366.
  5. Baretić M. 100 years of Hashimoto thyroiditis, still an intriguing disease //Acta.Med.Croatica.-2011. — Dec., V. 65(5). — P. 453–457.
  6. Bergmann P., Canni M. Blood tests and imaging in thyroid pathology//Rev.Med.Brux.-2012.-Sep., — V. 33(4). — P. 246–253.
  7. Gartner R. Modern diagnostic approach to autoimmune thyroiditis // MMW Fortschr.Med. — 2006. — V. 148, N 16. – P. 43–45.
  8. Hamilton TE, Davis S, Onstad L.  Thyrotropin levels in a population with no clinical, autoantibody, or ultrasonographic evidence of thyroid disease: implications for the diagnosis of subclinical hypothyroidism. //J Clin Endocrinol Metab.- 2008. – Vol.;93.- P.1224-30.
  9. Laurberg P, Pedersen KM, Hreidarsson A. Iodine intake and the pattern of thyroid disorders: a comparative epidemiological study of thyroid abnormalities in the elderly in Iceland and in Jutland, Denmark //J Clin Endocrinol Metab. – 1998. – Vol. 83.- P.765-769.
  10. McMonigal KA, Braverman LE, Dunn JT.Thyroid function changes related to use of iodinated water in the U.S. Space Program. //Aviat Space Environ Med.- 2000. – Vol. 71.-P.1120-5.
  11. Petersson U, Kjellström T.  Thyroid function tests, serum lipids and gender interrelations in a middle-aged population. //Scand J Prim Health Care.- 2001. – Vol. 19.- P.183-5.
  12. Sinclair D. Clinical and laboratory aspects of thyroid autoantibodies // Ann. Clin.Biochem. — 2006. — V. 43. — P. 173–183.
  13. Souchkevich G.N. main scientific results of the WHO International Programme on the Health Effects of the Chernobyl Accident (IPHECA). // Wourld Hearth Stat Q. -1996.– V.49.– P.209-212.
  14. Ticconi C., Giuliani E., Veglia M., Pietropolli A., Piccione E., Di Simone N. Thyroid autoimmunity and recurrent miscarriage //Am.J.Reprod.Immunol.-2011. — Dec., V. 66(6). — P. 452–459.
  15. Tozzoli R., Villalta D., Bizzaro N., Tonutti E., Manoni F.Laboratory diagnosis of autoimmune thyroid disease//Recenti.Prog.Med. —2001. —Oct., V. 92(10). — P. 609–617.
  16. Trbojevic B., Djurica S. Diagnosis of autoimmune thyroid disease // Srp. Arh. Celok Lek. —2005. — V. 133, N 1. — P. 25–33.
Оставьте ваш комментарий