ВВЕДЕНИЕ. Ухудшение экологической обстановки сопровождается значительным ростом заболеваний щитовидной железы (ЩЖ), особенно в районах, где снижено содержание йода в воде или повышена загрязненность окружающей среды, в том числе радиоактивными продуктами [1,9]. В последние десятилетия в разных странах проводят регулярные масштабные обследования функционального состояния ЩЖ как в группах риска или у населения определенных регионов, так и во всей популяции [8,10,11]. Это позволяет выявить дисфункцию ЩЖ на ранних стадиях и, в конечном итоге, обеспечивает проведение своевременной терапии и повышение качества жизни в целом [13].
В основе развития заболеваний щитовидной железы часто лежат аутоиммунные механизмы, связанные с выработкой аутоантител. Поэтому для более полной характеристики тиреоидного статуса пациента к скрининговым исследованиям на тиротропин (ТТГ) и тироксин (Т4) добавляют анализ на аутоантитела к тиреопероксидазе (ТПО) и тироглобулину (ТГ).
Определение концентраций антител к ТПО - один из наиболее чувствительных тестов для диагностики аутоиммунных заболеваний щитовидной железы, которые являются основным фактором, лежащим в основе гипотиреоза и гипертиреоза, и развиваются обычно у генетически предрасположенных людей. Определение уровня антител к ТГ позволяет оценить выраженность аутоиммунных реакций. Повышение уровня таких антител наблюдается в большинстве случаев тиреоидита Хашимото, болезни Грейвса и идиопатической микседемы. Антитела к тиреоглобулину обнаруживаются также у больных раком щитовидной железы при наличии регионарных метастазов [4-7,12, 14-16].
Уровень аутоантител обычно определяют в сыворотке крови. Однако для массовых исследований более удобно использовать высушенные на специальной фильтровальной бумаге пятна крови. Это связано с упрощением процедуры взятия капиллярной крови из пальца пациента, низкой стоимостью сбора, транспортировки и хранения проб в пластиковых герметичных пакетах, особенно из отдаленных регионов. Манипуляции с бумажными бланками более безопасны, чем с цельной кровью, так как многие опасные вирусы при высушивании теряют инфекционность вследствие разрушения вирусной оболочки [3].
Ранее нами продемонстрирована возможность определения тиротропина и свободного тироксина в сухих пятнах крови с использованием тестов, разработанных на основе метода лантанидного иммунофлуоресцентного анализа (ЛИФА) [2]. Уровень ТТГ и свободного Т4 в сухих пятнах крови в ЛИФА коррелировал с содержанием этих аналитов в сыворотке крови при исследовании в коммерческих тестах на основе иммуноферментного анализа (ИФА). В настоящей работе приведены результаты разработки на основе ЛИФА тестов для определения анти-ТГ и анти-ТПО в сухих пятнах крови и оценена возможность их использования совместно с ранее разработанными методиками (определение ТТГ и свободного Т4) для получения комплексной информации о тиреоидном статусе пациента.
Цель работы - разработка методик ЛИФА для выявления аутоиммунных антител к тироглобулину и тиреопероксидазе в высушенных на фильтровальной бумаге пятнах крови и их клиническая апробация в сравнении с результатами анализа сывороток в ИФА.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Клинические образцы в виде высушенных пятен крови получены из ООО «Научный центр ЭФиС» в 2012 году. Кровь у пациентов брали натощак из пальца и наносили в виде падающей капли на специальный бланк из фильтровальной бумаги Whatman 903 (США). Бланки с кровью высушивали на воздухе и хранили до исследования в герметично закрытом полиэтиленовом пакете при температуре +2-8оС. Предварительно сыворотки крови этих пациентов были исследованы на ауто-антитела к ТГ и ТПО с помощью иммуноферментных наборов фирмы DRG Inc., Германия.
Калибровочные пробы для разрабатываемых методик ЛИФА представляли собой сухие пятна крови, содержащие аутоиммунные антитела в концентрации 0, 30, 100, 300, 1000, 3000 МЕ/мл сыворотки (анти-ТГ) или 0, 10, 30, 100, 300, 1000 МЕ/мл сыворотки (анти-ТПО). Для их приготовления использовали сыворотки с высоким уровнем антител (по данным исследования наборами фирмы DRG), которые вносили в цельную кровь человека до необходимой концентрации, затем раскапывали по 100 мкл на фильтровальную бумагу Whatman 903 и высушивали. Приготовленные калибровочные пробы обеспечивали определение анти-ТГ и анти-ТПО в клинически значимом диапазоне концентраций и соответствовали по содержанию аналитов калибраторам из ИФА-наборов.
ЛИФА проводили как описано ранее [2] с использованием стадии предварительной экстракции аутоантител к ТГ и ТПО до постановки реакции. Из пятен крови на бумаге выбивали панчером диски диаметром 3,2 мм, помещали их в несорбирующий планшет и инкубировали в 100 мкл реакционного буфера при комнатной температуре и встряхивании. Необходимое число дисков и время экстракции определяли в предварительных экспериментах по оптимизации методик ЛИФА.
Стадии иммуноанализа включали инкубацию 75 мкл экстракта с тироглобулином или тиреопероксидазой (ООО «Хема», Москва), иммобилизованными в лунках 96-луночного стрипированного планшета, а затем с конъюгатом мышиных моноклональных антител против иммуноглобулина человека с ионами европия; на финальной стадии вносили усиливающий раствор и измеряли интенсивность флуоресценции на индикаторе Диагем (ЗАО ИММУНОСКРИН, Москва).
Концентрацию аутоантител к ТГ и ТПО в клинических образцах (сухих пятнах крови) определяли по соответствующим калибровочным кривым в разработанных на основе ЛИФА методиках. Для удобства интерпретации результатов значения концентраций приведены в пересчете на содержание антител в сыворотке.
РЕЗУЛЬТАТЫ.
В предварительных экспериментах по оптимизации разрабатываемых методик установлено следующее. Для достижения требуемого уровня чувствительности (какого?) при определении анти-ТГ и анти-ТПО антител достаточно использовать один сухой диск крови диаметром 3,2 мм. Это обеспечивает существенную экономию биоматериала по сравнению, например, с методикой иммуноанализа ТТГ, для проведения которой требуется не менее 5 дисков [2]. Для полной экстракции аутоантител в реакционный буфер, также как при определении ТТГ [2], было достаточно инкубировать пропитанный кровью диск в в течение 60 мин. при встряхивании.
Все последующие эксперименты проводили с учетом выбранного режима предварительной экстракции. Типичные калибровочные кривые, построенные в координатах «Интенсивность флуоресценции, имп/с – концентрация анти-ТПО или анти-ТГ в калибровочных пробах, МЕ/л», представлены на рисунке.
Рисунок. Типичные калибровочные кривые для определения анти-ТПО (А) и анти-ТГ (Б) антител в сухих пятнах крови
Калибровочные кривые были линейны на протяжении всего динамического диапазона концентраций аутоантител, содержащихся в калибровочных пробах: от 0 до 3000 МЕ/мл (анти-ТГ) или от 0 до 1000 МЕ/мл (анти-ТПО). Минимальная достоверно определяемая концентрация (чувствительность) в ЛИФА оказалась выше, чем в тестах на основе ИФА, составив 8 МЕ\мл для анти-ТГ или 3 МЕ/мл для анти-ТПО.
Воспроизводимость результатов измерений в сухих пятнах крови (коэффициент вариации) оценивали по результатам 12 повторных измерений каждого из 5 образцов с низкой, средней и высокой концентрацией аутоантител. Коэффициент вариации измерений не превысил 15% (таблица 1), что соответствует техническим требованиям, предъявляемым к методам измерений аналитов с использованием сухих пятен крови.
Таблица 1. Воспроизводимость результатов ЛИФА при измерении концентраций аутоиммунных антител к тироглобулину и тиреопероксидазе в высушенных на фильтровальной бумаге пятнах крови
Номер образца | Число измерений | Определение анти-ТГ | Определение анти-ТПО | ||
Концентрация, МЕ/мл | Коэффициент вариации, % | Концентрация, МЕ/мл | Коэффициент вариации, % | ||
1 | 12 | 12,2±1,1 | 9,0 | 12,3±1,8 | 14,6 |
2 | 12 | 18,7±2,7 | 14,7 | 29,3±4,4 | 15,0 |
3 | 12 | 23,5±3,1 | 13,2 | 155±18,6 | 12,0 |
4 | 12 | 81,4±10,1 | 12,4 | 161±13,1 | 8,1 |
5 | 12 | 2000±256 | 12,8 | 346±20,8 | 6,0 |
Клиническую апробацию разработанных методик ЛИФА с использованием сухих пятен крови (исследованы 23 пробы) проводилив сравнении с данными ИФА, полученными при исследовании сывороток крови тех же пациентов.
Для оценки результатов ИФА использовали рекомендации производителя тест-систем: пороговый уровень анти-ТПО антител - 50 МЕ\мл, концентрация 50-75 МЕ\мл считается пограничной, повышенный уровень антител соответствует значениям, превышающим 75 МЕ\мл. Для анти-ТГ антител эти значения составляют 100 МЕ\мл (пороговый уровень), 100-150 МЕ\мл (пограничная концентрация), более 150 МЕ\мл (повышенный уровень).
С учетом этих рекомендаций нормальный уровень анти-ТПО или анти-ТГ антител в сыворотке крови установлен методом ИФА, соответственно, у 9 из 23 (39%) или у 9 из 10 (90%) обследованных пациентов (Таблица 2). Повышенный уровень анти-ТПО антител выявлен у 14 из 23 (61%) пациентов.
Результаты определения в ЛИФА концентраций анти-ТГ и анти-ТПО антител при исследовании клинических образцов (сухих пятен крови) приведены в таблице 2 в сопоставлении с данными анализа сывороток, полученных от тех же пациентов, в коммерческих ИФА-наборах.
Результаты определения концентраций анти-ТПО и анти-ТГ методом ЛИФА в сухих пятнах крови пациентов с различным тиреоидным статусом Таблица 2
№ п\п | Измерено в ИФА (анализ сывороток) | Измерено в ЛИФА (анализ сухих пятен крови) | ||||||
концентра-ция ТТГ, мкМЕ\мл (ПУ 0,2-5) | концентра-ция свТ4, пмоль\л | концентра-ция, анти-ТПО, МЕ\мл (ПУ 50) | концентра-ция, анти-ТГ, МЕ\мл (ПУ 100) | концентра-ция ТТГ, мкМЕ\мл | концентра-ция свТ4, пмоль\л | концентра-ция, анти-ТПО, МЕ\мл (ПУ 50) | концентра-ция, анти-ТГ, МЕ\мл (ПУ 100) | |
1 | <0,01 | 16,5 | - | <20 | <0,2 | 17,82 | - | 8,46 |
2 | <0,01 | 52,14 | - | <20 | <0,2 | 50,09 | - | 6,77 |
5 | 0,19 | 10,26 | <10 | 28,8 | 0,24 | 10,07 | 9,2 | 104 |
10 | 1,99 | 9,51 | <10 | - | 2,27 | 11,53 | 4,2 | - |
14 | 4,22 | 9,43 | <10 | <20 | 4,76 | 10,63 | 8,6 | 23,5 |
7 | 0,50 | 14,4 | 12,3 | <20 | 0,69 | 13,47 | 8,4 | 11,5 |
8 | 0,88 | 8,22 | 13 | <20 | 1,09 | 10,42 | 11,8 | 7,45 |
11 | 2,72 | 15,95 | 28,9 | - | 3,6 | 14,37 | 12,4 | - |
6 | 0,33 | 14,05 | 29,3 | - | 0,4 | 13,94 | 9,6 | - |
18 | 11,1 | 8,6 | 155 | <20 | 12,7 | 8,21 | 138 | 18,7 |
16 | 7,0 | 9,41 | 161 | - | 7,8 | 10,61 | 133 | - |
9 | 1,13 | 10,4 | 262 | 88,7 | 1,27 | 11,09 | 184 | - |
4 | 0,024 | 22,82 | 346 | - | <0,2 | 25,95 | 169 | - |
13 | 4,2 | 11,84 | 398 | - | 4,9 | 10,53 | 243 | - |
15 | 4,67 | 11,76 | 420 | - | 4,72 | 10,12 | 129 | - |
20 | 16,3 | 10,23 | 432 | - | 17,6 | 12,3 | 241 | - |
3 | <0,01 | 21,65 | > 1000 | - | <0,2 | 22,72 | 438 | - |
12 | 2,92 | 8,73 | > 1000 | > 3000 | 3,41 | 7,98 | 3230 | 2000 |
17 | 7,02 | 9,45 | > 1000 | - | 7,98 | 8,24 | 698 | - |
19 | 11,58 | 12,44 | > 1000 | - | 13,2 | 13,84 | 635 | - |
21 | 18,1 | 9,76 | > 1000 | <20 | 20,0 | 8,93 | 1550 | 12,2 |
22 | 27,1 | 8,55 | > 1000 | - | 29,2 | 7,86 | 3370 | - |
23 | 173,8 | 7,92 | > 1000 | - | 189,3 | 7,02 | 606 | - |
Примечание: “-“ – значение не измеряли
Как видно из приведенной таблицы результатов, концентрации аутоантител, измеренные в сухих пятнах, демонстрируют хорошее совпадение с результатами анализа сывороток крови пациентов, полученных с использованием коммерческих тест-систем. Приведенные результаты позволяют предположить, что разработанные методики могут адекватно отражать тиреоидный статус. Анализ сухих пятен крови в ЛИФА обеспечивает определение значений концентраций аутоантител, в основном, сходных с референс-значениями, установленными производителями ИФА-наборов. Также разработанный подход правильно характеризует исследуемые образцы по параметру норма/патология. В качестве порогового значения нормы для анти-ТГ было выбрано значение 100 МЕ/мл, а для анти-ТПО – 50 МЕ/мл в пересчете на сыворотку. Клинические образцы как, например, №3, 5, 7, показывающие аутоиммунные изменения (повышенный уровень ТПО), имеют также повышенный уровень ТТГ (предварительно измеренный в ИФА), что позволяетпредположить состояние гипотиреоза и аутоиммунного тироидита. Такой результат необходимо проверить с учетом общей клинической картины состояния пациента. Образцы, показывающие повышенный уровень аутоантител и нормальные показатели концентраций ТТГ и Т4, также обращают на себя внимание, так как эти пациенты в следствие своего иммунного статуса нуждаются в наблюдении эндокринолога, и, возможно, иммунолога; регулярном контроле состояния функции щитовидной железы, что в случае развития гипотиреоза позволит своевременно начать корректирующую гормональную терапию. Таким образом, применение описанных методик выявления аутоантител в комплексе с количественным определением концентраций ТТГ и Т4 в сухих пятнах крови по аналогичным ранее апробированным методикам позволит получить полную картину тиреоидного статуса пациента.
ВЫВОДЫ
Разработаны, оптимизированы и апробированы методики измерения уровня аутоантител к щитовидной железе (анти-ТГ и анти-ТПО) в высушенных на бумажных бланках пробах крови. Разработанные тесты в комплексе с ранее описанными тестами для определения ТТГ и Т4 в сухом пятне крови могут составить основу для массового, скринингового обследования щитовидной железы, что может быть полезно при мониторинге влияния различных вредных факторов производства и окружающей среды на здоровье персонала и населения проблемных регионов.
ЛИТЕРАТУРА